质谱技术在脑卒中生物标志物发现中的应用

摘要

脑卒中是指由于脑部供血突然降低或中断导致脑组织损伤的一类疾病，具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点。近年来，质谱技术凭借高灵敏度和特异性的特点，在疾病生物标志物的发现中展现出巨大潜力。在脑卒中临床确诊前到康复期间，患者体内会发生大量代谢物和蛋白质的变化，这可能为基于质谱的临床前诊断、院前急救和预后评估提供契机。该文主要综述了近十年质谱技术在脑卒中代谢和蛋白生物标志物发现中的代表性工作。在代谢生物标志物方面，梳理了与脑卒中相关的能量代谢物、氨基酸和脂质等；在蛋白生物标志物方面，梳理了与脑卒中相关的基质金属蛋白酶、金属蛋白和纤维蛋白原等。该文对揭示脑卒中的病理生理机制及推动质谱技术在脑卒中临床辅助诊断中的应用具有重要意义。

Abstract

Stroke is a class of diseases caused by a sudden decrease or interruption in cerebral blood supply，resulting in brain tissue damage. It is characterized by high prevalence，high mortality，and high disability rates. Recently，mass spectrometry has demonstrated immense potential in the discovery of disease biomarkers，owing to its high sensitivity and specificity. Notably，from the period before the clinical determination of stroke to recovery，significant changes in metabolites and proteins occur in the body of the patient，which may provide opportunities for mass spectrometry-based diagnosis before clinical determination，pre-hospital emergency care，and prognosis assessment. This article primarily reviews the representative works in the discovery of metabolic and protein biomarkers using mass spectrometry over the past decade. In the realm of metabolic biomarkers，we compile those associated with energy metabolites，amino acids，and lipids relevant to stroke. Regarding protein biomarkers，we discuss stroke-related matrix metalloproteinases，metalloproteins，and fibrinogen，among others. This review is significant in revealing the pathophysiological mechanisms of stroke and advancing the application of mass spectrometry for stroke diagnosis in clinical setting.

关键词

脑卒中; 质谱; 生物标志物; 代谢组学; 蛋白组学

Keywords

stroke; mass spectrometry; biomarkers; metabolomics; proteomics

脑卒中（Stroke）是一种严重的脑血管疾病，是因脑部血管突然破裂或阻塞导致大脑无法得到足够的血液供应，从而引发的脑组织缺血缺氧性损伤［1］。根据世界卫生组织的报道，脑卒中是全球第二大死因（占总死亡人数的11.6%）和第三大致残原因（占总伤残调整寿命年的5.7%）［2-4］。2019年，全球脑卒中患者总数为1.01亿，其中新发病例为1 220万，死亡人数高达655万［2］。据美国心脏协会报告，与脑卒中相关的医疗费用预计将从2012年的715.5亿美元增加到2030年的1 831.3亿美元［5］。我国脑卒中患者数量位居世界第一，2020年，我国40岁以上人群中，脑卒中患者达1 780万，其中新发病例为340万，与脑卒中相关的死亡人数约230万［6］。目前，常用的脑卒中临床治疗方法有溶栓治疗、抗血小板治疗、抗凝治疗和手术治疗。其中，组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）溶栓治疗是治疗缺血性脑卒中（IS）最有效的方法之一［7］。然而，t-PA的治疗时间窗口应在4.5 h内，仅有4%的脑卒中患者能及时接受t-PA治疗［8］。超过4.5 h后进行t-PA治疗会增加出血性转化的风险［9］。因此建立早期高效的脑卒中筛查和辅助诊断方法对降低脑卒中的死亡率和致残率至关重要，并将为临床诊断和治疗提供重要的支持和指导。

医学影像学技术是当前脑卒中临床诊断的主要方法，常用的有计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）。这些技术能非侵入性地进行脑组织功能的定性定量评估，为疾病临床诊断提供依据［10］。中国急性缺血性脑卒中诊治指南［11］提出，应根据患者的病因选择合适的影像学检查方法（如图1所示）。这些影像学检查有助于确定脑卒中患者的病因、病灶位置和大小，对风险预测、精准诊断和预后评估起关键作用［12］。但是，基于影像学检查的脑卒中诊断存在依赖大型设备和专业技术人员的问题，使其在临床确诊脑卒中前的风险评估和预后评估中的应用受限。Liu等［13］在前瞻性巢式病例对照研究中发现丝氨酸蛋白酶1甲基化的改变在临床确诊脑卒中前2年即可检测到，且在确诊前1.5年时变化更明显，表明外周血中的该DNA甲基化特征可能是脑卒中风险评估和临床前检测的潜在生物标志物。此外，可靠的诊断性生物标志物有望为脑卒中前阶段的诊断提供重要支持［14］。因此，研究生物标志物可能对脑卒中临床前诊断、院前急救和预后评估有重要作用

图1 用于脑卒中诊断的各影像学检查的总结

Fig.1 Summary of the various imaging tests used for stroke diagnosis

CTP（计算机断层扫描灌注成像），CTA（计算机断层扫描血管造影术），DWI（扩散加权成像），DTI（扩散张量成像），PWI（磁共振灌注加权成像），MRA（磁共振血管造影），SWI（磁敏感加权成像），ASL（动脉自旋标记），MRS（磁共振波谱），AIS（急性缺血性脑卒中）

质谱技术是一种灵敏且特异的分析方法，结合色谱分离技术能够解析复杂生物样品的化学成分，揭示其结构与组成［15-16］。通过对脑卒中患者的生物样本（如血液）进行分析，可以发现与脑卒中相关的生物标志物（如炎症标志物、血栓相关分子和脑损伤标志物等）。目前已有多项研究和综述探讨了脑卒中发病过程中代谢物和蛋白质发生的变化［17-21］，揭示了发病过程中多种生物标志物含量变化与患者的临床特征或预后结果存在相关性。这些发现有助于更好地理解脑卒中的病理生理机制，为脑卒中的早期筛查、辅助诊断和预后评估提供手段。本文综述了近十年来基于质谱技术的脑卒中代谢组学和蛋白组学研究，以期为相关研究提供可能的研究思路和方向。

1 基于质谱的脑卒中代谢标志物研究

代谢组学是一门系统性地研究生物体内源性代谢物变化和功能的学科，可以反映生物体在外界环境影响和体内机制互动下的整体生理状态［22-23］。质谱技术结合代谢组学方法在脑卒中生物标志物研究中起着核心作用，可揭示脑卒中的病理生理反应和发病机制之间的关联。表1总结了部分具有代表性的脑卒中代谢组学研究成果，显示出多种涉及能量代谢、氨基酸和脂质代谢的小分子可能与脑卒中的发病机制和分型存在相关性。

表1 与脑卒中相关的小分子代谢标志物

Table 1 Small molecule metabolic markers associated with stroke

脑组织功能的正常运行依赖于充足的血液供应和线粒体氧化磷酸化产生的能量［31］，当IS发生后，脑组织通过无氧呼吸产生能量，导致产生的丙酮酸量超过三羧酸（TCA）循环的分解能力，过多的丙酮酸将经糖酵解途径转化为乳酸。Wu等［32］运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF MS）检测大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠和假手术组血清内源性代谢物的差异，发现乳酸可以反映核心区域的缺血程度。Wang等［24］基于气相色谱-质谱（GC-MS）的代谢组学表征了急性缺血性脑卒中（AIS）的代谢物特征，发现乳酸可以作为AIS的潜在生物标志物。以上研究表明，脑组织缺血缺氧会抑制TCA循环功能，并导致乳酸积累。提示乳酸可以作为脑卒中病理生理过程中的关键生物标志物，有望成为脑卒中早期诊断的潜在生物指标。通过检测乳酸水平和TCA的循环能力，可以为脑卒中的辅助诊断提供依据。译

氨基酸代谢在产生能量、合成脂肪和碳水化合物等过程中发挥了关键作用。谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，对多种大脑功能有直接或间接的影响。Tanaka等［33］采用基于毛细管电泳-飞行时间质谱（CE-TOF MS）的代谢组学评估了MCAO大鼠接受细胞治疗后的代谢特征，发现MCAO大鼠梗死区域谷氨酸含量显著降低，梗死周围区域显著升高。支链氨基酸（BCAAs）包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸3种常见氨基酸。研究发现，脑卒中患者体内BCAAs浓度的降低与神经功能预后不良呈正相关［34］。Ruiz-Canela等［35］使用液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）对心血管疾病患者和健康受试者的血浆进行检测，发现BCAAs水平与IS的风险呈正相关。半胱氨酸是人体含硫的非必需氨基酸之一，是蛋氨酸代谢过程的中间产物。高同型半胱氨酸血症是心脑血管疾病的危险因素，可以促进动脉粥样硬化斑块的形成从而损伤血管［36］。Lee等［25］使用基于超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF MS/MS）的代谢组学对62名有IS风险的患者和348名未发生脑卒中的受试者的血清进行分析，发现有脑卒中风险患者的血清中同型半胱氨酸亚磺酸水平明显高于无风险受试者。上述研究结果表明氨基酸代谢紊乱与脑卒中存在紧密关联。这些发现有助于深入理解脑卒中的病理机制并可为相关治疗和预防措施的发展提供启示。译

脂质代谢是指人体内脂肪酸、脂肪酸衍生物和脂蛋白等脂类物质的代谢过程。研究发现脑组织缺血缺氧时，会激活N-甲基-D-天冬氨酸受体，使细胞外的钙离子进入细胞内，介导磷脂酶A2激活，导致甘油磷脂水解为游离的花生四烯酸［37］。花生四烯酸作为磷脂膜的主要成分，参与机体生命过程中的信号传导和基因转录。Yang等［38］使用基于UPLC-Q-TOF MS/MS的代谢组学评估脑组织的代谢物变化，发现与假手术组相比，IS大鼠模型的花生四烯酸水平显著升高。另外，脂蛋白是心血管疾病的危险因素，其异常可能导致胆固醇在动脉壁沉积，形成动脉粥样硬化斑块［39］。Ma等［40］采用四维无标记定量法的数据独立采集-同步累积连续碎裂（4DLFQ-diaPASEF）技术分析高血压IS患者血清蛋白谱的变化，发现与无IS的高血压患者相比，IS高血压患者血清缺血修饰白蛋白、脂蛋白磷脂酶A2和胶质纤维酸性蛋白水平显著升高。鞘氨醇是鞘脂的组成之一，参与机体的脂质代谢过程。Sun等［26］采用UPLC-Q-TOF MS/MS对IS患者血清进行检测，发现鞘氨醇可以作为诊断IS的潜在生物标志物。鞘磷脂是一种由鞘氨醇、磷酸和胆碱等物质组成的鞘脂。Lind等［27］使用UPLC-Q-TOF MS检测IS患者的血浆代谢物，发现28种代谢物水平与IS的发病率相关，其中鞘磷脂水平与IS发生风险呈负相关。以上研究表明脂质代谢异常可能导致细胞膜的组成发生改变，引起细胞膜损伤，这一过程可能是导致神经细胞损伤的关键机制之一。译

上述关于脑卒中的研究主要涉及非靶向代谢组学的生物标志物发现，而结合靶向代谢组学的大规模验证是将生物标志物推向实际应用的关键步骤。Yu等［41］使用高分辨液相色谱-质谱（LC-MS）对150名IS患者和50名健康受试者的血浆样本进行非靶向代谢组学研究，发现IS患者的苯乙酰谷氨酰胺显著增加，他们采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱（HPLC-TQMS）对751名IS患者和200名健康受试者的血浆样本进行靶向验证，结果显示IS患者体内的苯乙酰谷氨酰胺水平比健康受试者显著升高。Khan等［42］运用基于UPLC-Q-TOF MS/MS的非靶向代谢组学发现35种代谢物（19种上调和16种下调）与脑卒中的风险相关，并基于UPLC-Q-TOF MS/MS的靶向代谢组学对99名有脑卒中风险的患者和301名无风险受试者的血清样本进行进一步定量和验证，证实有脑卒中风险患者血清中存在16种关键代谢物（10种上调和6种下调）。上述研究采用非靶向代谢组学生物标志物发现结合靶向大规模验证的模式，凸显了高分辨质谱在临床代谢标记物发现中高灵敏、高特异的优势，以及在大规模人群中进行靶向代谢组学验证的必要性。译

2 基于质谱的脑卒中蛋白标志物研究

蛋白质组学是研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成及其变化规律的学科，可以揭示脑卒中患者体内蛋白质的表达变化［43］，为疾病生物标志物的识别、验证和应用提供了可靠的研究方法。脑卒中会引起一系列病理生理过程，导致细胞损伤和炎症反应，从而影响多种蛋白质的表达。表2总结了与脑卒中相关的蛋白质标志物，它们在反映脑卒中的发生、发展和预后等方面具有不同的作用和意义。这些蛋白质标志物的发现不仅有助于理解脑卒中的病理生理过程和发病机制，还为脑卒中的早期诊断提供了潜在的候选生物标志物。

表2 与脑卒中相关的蛋白质标志物

Table 2 Protein markers associated with stroke

基质金属蛋白酶（MMPs）是一组多样化的内肽酶，能够降解细胞外基质中的多种蛋白质，参与机体血管生成和细胞迁移等多种生理过程［51］。Yi等［52］使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）法分析了不同严重程度IS患者血浆中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）基因的6个变异体，发现MMP-9多态性与重度卒中呈高度独立相关。同时Yi等［53］还发现MMP-9多态性与IS后出血性转化有密切关系。

金属蛋白在脑卒表型中也发挥着重要作用，Datta等［54］通过8-plex同位素标记相对和绝对定量技术结合二维液相色谱-串联质谱（8-plex iTRAQ-2D-LC-MS/MS）研究脑卒中患者3个不同脑区域（壳核、丘脑和顶叶）梗死组织的蛋白质组，发现反应性胶质细胞增生相关蛋白、抗炎反应相关蛋白和铁蛋白可能是IS诊断的潜在生物标志物。

纤维蛋白原（Fg）是血小板聚集、血栓形成和动脉粥样硬化形成过程中的反应底物。C-反应蛋白（CRP）是机体受到感染时血浆中急剧上升的一种急性时相反应蛋白，对细胞因子平衡有重要的调节功能［55］。Dagonnier等［44］使用液相色谱-串联轨道阱质谱（LC-Orbitrap MS/MS）技术检测IS患者血清样本，发现Fg和CRP在AIS中具有显著的临床应用前景。译

此外，还有其它蛋白质与脑卒中存在一定的相关性。Lai等［56］基于EASY-nLC线性阱-轨道阱质谱（EASY-nLC-LTQ-Orbitrap MS）技术的蛋白组学和代谢组学方法，研究了急性进行性缺血性脑卒中（APIS）和急性非进行性缺血性脑卒中（ANPIS）的病理生理过程，发现血清淀粉样蛋白A1和S100钙结合蛋白A9是区分APIS和ANPIS的潜在生物标志物。Rossi等［57］使用EASY-nLC-Orbitrap MS/MS技术研究了一组有望区分心源性栓塞和大动脉粥样硬化病因的蛋白质标志物，从而可以更好地研究AIS的病理生理。Gawryś等［58］对AIS患者和对照组的血小板进行了基于反相液相色谱联合轨道阱质谱（RP-HPLC-Orbitrap MS）的蛋白组学研究，发现β-淀粉样蛋白、胸苷磷酸化酶和组蛋白等有成为AIS诊断标志物的潜力。

综上所述，使用质谱技术探索脑卒中的生物标志物是一种有效的方法，能较好地反映出机体在早期阶段遭受的损伤，涉及能量代谢紊乱、兴奋性神经毒性、氧化应激和神经系统损伤等。这些生物标志物初步表现出应用于脑卒中风险评估和早期诊断的潜力。然而，当前的研究仍存在一些限制，例如这些标志物大多为单一物质，而脑卒中的病因复杂且临床症状多样。单一生物标志物缺乏足够的特异性和灵敏度，因此尚无广泛的临床应用实践。为了解决这一问题，可以结合多个生物标志物，并利用合适的统计方法和工具对生物标志物组合进行评估，以选取较佳的组合用于脑卒中的风险评估和早期诊断，从而提高脑卒中诊断的特异性和灵敏度［59］。

3 结论及展望

脑卒中作为一种严重的脑血管疾病，不仅是全球主要的死亡和致残原因之一，同时也对公共卫生和经济造成了重大负担。近年来，基于质谱技术的代谢组学和蛋白组学迅速发展，在脑卒中生物标志物的研究方面取得了大量成果。这些生物标志物为脑卒中的临床前诊断、院前急救和预后评估提供了关键的生物学依据。

在未来脑卒中生物标志物的研究中，质谱新技术和化学计量学新算法可能起到关键的推动作用。大气压质谱分析技术，如表面解吸常压化学电离、电喷雾解吸电离和探针电喷雾离子源等可以直接且高效地获取组织样本中的生物分子信息，无需复杂的预处理步骤，有望为临床前诊断、院前急救、预后评估等场景提供方便的手段。拟靶向代谢组学兼具非靶向代谢组学的高覆盖和靶向代谢组学精确定量的优点，可能提高潜在代谢标志物发现和大规模验证的效率。同时，基于现代数据挖掘和机器学习的新方法，有望在生物标志物组的预测效能和解释性方面有所突破。此外，生物标志物组在大规模人群队列研究中的验证，尤其是多中心联合研究和数据共享机制的方式，有助于提高研究结果的一致性和可重复性，也是将发现的脑卒中生物标志物推向实际应用的关键步骤。

参考文献

1 Joy M T，Carmichael S T. Nat. Rev. Neurosci.，2021，22（1）：38-53.

2 GBD 2019 Stroke Collaborators. Lancet Neurol.，2021，20（10）：795-820.

3 GBD 2019 Diseases and Injuries Collaborators. Lancet，2020，396（10258）：1204-1222.

4 Report on Stroke Center in China Writing Group. Chin. J. Cerebrovasc. Dis.（《中国卒中中心报告2020》编写组. 中国脑血管病杂志），2021，18（11）：737-743.

5 Gorelick P B. Lancet. Neurol.，2019，18（5）：417-418.

6 Tu W J，Zhao Z P，Yin P，Cao L，Zeng J S，Chen H S，Fan D S，Fang Q，Gao P，Gu Y S，Tan G J，Han J F，He L，Hu B，Hua Y，Kang D Z，Li H Y，Liu J M，Liu Y L，Lou M，Luo B Y，Pan S Y，Peng B，Ren L J，Wang L H，Wu J，Xu Y M，Xu Y，Yang Y，Zhang M，Zhang S，Zhu L F，Zhu Y C，Li Z X，Chu L，An X L，Wang L X，Yin M，Li M，Yin L，Yan W，Li C，Tang J L，Zhou M G，Wang L D. JAMA Network Open.，2023，6（3）：e231455.

7 Marshall R S. JAMA Neurol.，2015，72（8）：928-934.

8 Kong L L，Gao L，Wang K X，Liu N N，Liu C D，Ma G D，Yang H G，Qin X M，Du G H. Acta Pharmacol. Sin.，2021，42（8）：1223-1234.

9 Hacke W，Kaste M，Bluhmki E，Brozman M，Dávalos A，Guidetti D，Larrue V，Lees K R，Medeghri Z，Machnig T，Schneider D，von Kummer R，Wahlgren N，Toni D. N. Engl. J. Med.，2008，359（13）：1317-1329.

10 Di B L，Bonura A，Caminiti M L，Pecoraro P M，Di L V. Ann. Med.，2022，54（1）：2658-2671.

11 Chinese Society of Neurology，Cerebrovascular Disease Group of Chinese Society of Neurology. Chin. J. Neurol.（中华医学会神经病学分会，中华医学会神经病学分会脑血管病学组. 中华神经科杂志），2018，51（9）：666-682.

12 Gil-Garcia C A，Flores-Alvarez E，Cebrian-Garcia R，Mendoza-Lopez A C，Gonzalez-Hermosillo L M，Garcia-Blanco M D，Roldan-Valadez E. Curr. Probl. Cardiol.，2022，47（11）：101328.

13 Liu C L，Li M X，Yin Q M，Fan Y，Shen C，Yang R X. Clin. Epigenet.，2022，14（1）：191.

14 Simpkins A N，Janowski M，Oz H S，Roberts J，Bix G，Doré S，Stowe A M. Transl. Stroke Res.，2020，11（4）：615-627.

15 Alseekh S，Aharoni A，Brotman Y，Contrepois K，D’Auria J，Ewald J，Ewald J C，Fraser P D，Giavalisco P，Hall R D，Heinemann M，Link H，Luo J，Neumann S，Nielsen J，de Souza L P，Saito K，Sauer U，Schroeder F C，Schuster S，Siuzdak G，Skirycz A，Sumner L W，Snyder M P，Tang H，Tohge T，Wang Y L，Wen W W，Wu S，Xu G W，Zamboni N，Fernie A R. Nat. Methods，2021，18（7）：747-756.

16 Lu H Y，Zhang H，Xiao Y P，Li Y，Gu H W，Chen H W. J. Instrum. Anal.（卢海艳，张华，肖义坡，李毅，顾海巍，陈焕文. 分析测试学报），2017，36（2）：152-160.

17 Hochrainer K，Yang W. Circ. Res.，2022，130（8）：1145-1166.

18 Du Z H，Lu Y，Wang L P. Chin. J. Anal. Chem.（都展宏，鲁艺，王立平. 分析化学），2019，47（10）：1651-1663.

19 Montaner J，Ramiro L，Simats A，Tiedt S，Makris K，Jickling G C，Debette S，Sanchez J C，Bustamante A. Nat. Rev. Neurol.，2020，16（5）：247-264.

20 Bernhardt A M，Tiedt S，Teupser D，Dichgans M，Meyer B，Gempt J，Kuhn P H，Simons M，Palleis C，Weidinger E，Nübling G，Holdt L，Hönikl L，Gasperi C，Giesbertz P，Müller S A，Breimann S，Lichtenthaler S F，Kuster B，Mann M，Imhof A，Barth T，Hauck S M，Zetterberg H，Otto M，Weichert W，Hemmer B，Levin J. eBioMedicine，2023，89：104456.

21 Debette S，Chasman D I. Nat. Rev. Neurol.，2024，20（2）：65-66.

22 Wang Z X，Li X，Zeper A. Prog. Chem. （王子璇，厉欣，再帕尔·阿不力孜. 化学进展），2021，33（3）：406.

23 Sun X S，Lu X，Xu G W. J. Chin. Mass Spectrom. Soc.（孙晓珊，路鑫，许国旺. 质谱学报），2021，42（5）：787-803.

24 Wang D，Kong J，Wu J Y，Wang X X，Lai M C. Neurosci. Lett.，2017，642：7-13.

25 Lee Y，Khan A，Hong S，Jee S H，Park Y H. Mol. Biosyst.，2017，13（6）：1109-1120.

26 Sun H X，Zhao J Y，Zhong D，Li G Z. PloS One，2017，12（12）：e0189009.

27 Lind L，Salihovic S，Ganna A，Sundström J，Broeckling C D，Magnusson P K，Pedersen N L，Siegbahn A，Prenni J，Fall T，Ingelsson E，Ärnlöv J. J. Stroke Cerebrovasc. Dis.，2020，29（2）：104476.

28 Goulart V A M，Sena M M，Mendes T O，Menezes H C，Cardeal Z L，Paiva M J N，Sandrim V C，Pinto M C X，Resende R R. Biomed. Res. Int.，2019，2019：8480468.

29 Hu Z S，Zhu Z T，Cao Y F，Wang L X，Sun X Y，Dong J，Fang Z Z，Fang Y H，Xu X X，Gao P，Hongzhi S. J. Clin. Lab. Anal.，2016，30（6）：823-830.

30 Qi A，Liu L L，Zhang J J，Zhang L J，Cai C. J. Chin. Mass Spectrom. Soc.（祁奥，刘璐璐，张俊杰，张立坚，蔡春. 质谱学报），2021，42（5）：962-974.

31 Sarkar S，Chakraborty D，Bhowmik A，Ghosh M K. Front. Biosci. -Landmark，2019，24（3）：415-430.

32 Wu L L，Chen C，Li Y B，Guo C，Fan Y Q，Yu D R，Zhang T L，Wen B Y，Yan Z Y，Liu A. ACS Omega，2020，5（51）：33433-33444.

33 Tanaka E，Ogawa Y，Fujii R，Shimonaka T，Sato Y，Hamazaki T，Nagamura-Inoue T，Shintaku H，Tsuji M. Sci. Rep.，2020，10（1）：21881.

34 Kimberly W T，Wang Y，Pham L，Furie K L，Gerszten R E. Stroke，2013，44（5）：1389-1395.

35 Ruiz-Canela M，Toledo E，Clish C B，Hruby A，Liang L M，Salas-Salvadó J，Razquin C，Corella D，Estruch R，Ros E，Fitó M，Gómez-Gracia E，Arós F，Fiol M，Lapetra J，Serra-Majem L，Martínez-González M A，Hu F B. Clin. Chem.，2016，62（4）：582-592.

36 Zhang O，Liu Y，Meng H J，Cong S Y. Chin. J. Public Health（张鸥，刘洋，蒙航娟，丛树艳. 中国公共卫生），2021，37（12）：1840-1844.

37 Kloska A，Malinowska M，Gabig-Cimińska M，Jakóbkiewicz-Banecka J. Int. J. Mol. Sci.，2020，21（10）：3618.

38 Yang Y H，Lei L，Bao Y P，Zhang L. Front. Mol. Biosci.，2022，9：783793.

39 Langsted A，Nordestgaard B G，Kamstrup P R. J. Am. Coll. Cardiol.，2019，74（1）：54-66.

40 Ma J，Shen L K，Bao L，Yuan H，Wang Y X，Liu H，Wang Q. J. Clin. Lab. Anal.，2021，35（5）：e23756.

41 Yu F，Li X，Feng X J，Wei M P，Luo Y F，Zhao T T，Xiao B，Xia J. Front. Cardiovasc. Med.，2021，8：798765.

42 Khan A，Shin M S，Jee S H，Park Y H. Analyst，2020，145（5）：1695-1705.

43 Zhang Y，Fonslow B R，Shan B，Baek M C，Yates J R. Chem. Rev.，2013，113（4）：2343-2394.

44 Dagonnier M，Cooke I R，Faou P，Sidon T K，Dewey H M，Donnan G A，Howells D W. Biomarker Insights，2017，12. doi：10.1177/1177271917749216.

45 Qin C，Zhao X L，Ma X T，Zhou L Q，Wu L J，Shang K，Wang W，Tian D S. J. Transl. Med.，2019，17（1）：214.

46 Malicek D，Wittig I，Luger S，Foerch C. Front. Neurol.，2021，12：713124.

47 Bian F，Simon R P，Li Y，David L，Wainwright J，Hall C L，Frankel M，Zhou A. Stroke，2014，45（4）：1177-1179.

48 George P M，Mlynash M，Adams C M，Kuo C J，Albers G W，Olivot J. Int. J. Stroke，2015，10（8）：1204-1211.

49 Zhao X L，Tao R，Yang Y，Pan D J，Guo H. Acta Med. Univ. Sci. Technol. Huazhong（赵新玲，陶然，杨园，潘邓记，郭虹. 华中科技大学学报：医学版），2018，47（5）：594-598.

Pang X M，Zhou X，Su S Y，Chen C Y，Wei Z X，Tao Y F，Liu J L. Proteomics Clin. Appl.，2019，13（5）：1900009.

Chang Q，Yang Y Y，Xue Q，Song A X，Wang H H. Chin. J. Gerontol.（常青，杨宇英，薛茜，宋爱霞，王欢欢. 中国老年学杂志），2022，42（9）：2077-2081.

52 Yi X Y，Zhou Q，Sui G，Fan D F，Zhang Y Y，Shao M J，Han Z，Luo H，Lin J，Zhou J. Brain Behav.，2019，9（6）：e01291.

53 Yi X Y，Sui G，Zhou Q，Wang C，Lin J，Chai Z X，Zhou J. Brain Behav.，2019，9（6）：e01294.

54 Datta A，Akatsu H，Heese K，Sze S K. J. Proteomics，2013，91：556-568.

55 Arévalo-Lorido J C，Carretero-Gómez J，Fernández-Recio J M，Alvarez-Oliva A，Gutiérrez-Montaño C，Najarro-Díez F，Martín-Sánchez M J. Ann. Med.，2015，47（3）：226-232.

56 Lai M C，Zhang X J，Zhou D Y，Zhang X J，Zhu M T，Liu Q X，Zhang Y，Wang D. J. Proteomics，2022，261：104581.

57 Rossi R，Mereuta O M，Silva M，Gil S M，Douglas A，Pandit A，Gilvarry M，McCarthy R，O’Connell S，Tierney C，Psychogios K，Tsivgoulis G，Szikora I，Tatlisumak T，Rentzos A，Thornton J，Broin P，Doyle K M. Front. Neurol.，2022，13：854846.

58 Gawryś K，Turek-Jakubowska A，Gawryś J，Jakubowski M，Dębski J，Szahidewicz-Krupska E，Trocha M，Derkacz A，Doroszko A. J. Clin. Med.，2022，11（5）：1198.

59 Zhang J，Yuan T，Wei S X，Feng Z H，Li B Y，Huang H. RSC Adv.，2022，12（23）：14716-14723.