Research and Application Prospect of Organoid Technique in Radiotherapy of Pancreatic Cancer TONG Jiaojiao, LIANG Yiyin, CHEN Liang, XU Bichun, ZHANG Huojun Department of Radiation Oncology, The First Affiliated Hospital of Naval Medical University, Shanghai 200433, China Corresponding Author: ZHANG Huojun, E-mail: chyyzhj@163.com
Abstract: Pancreatic cancer, as a common malignant tumor of the digestive system, has a very low survival rate. In recent years, pancreatic cancer has made great progress in diagnostic methods, radiation therapy techniques, and systemic chemotherapy, but its therapeutic effect has not been considerably improved. As a new type of tumor research platform, organoids have made research progress in many fields. Constructing pancreatic cancer organoids is of great research value to guide the individualized treatment of pancreatic cancer. This article reviews the research and clinical application prospect of organoid model in radiotherapy of pancreatic cancer.
Key words: Pancreatic cancer; Organoids; Tumor model; Radiotherapy
Funding: National Natural Science Foundation of China (No. 82272742); Shanghai Health Commission Talent Program (No. 2022LJ019); National Key Research and Development Program of China (No. 2022YFC2503701); Changhai Hospital “Guhai” Program (No. GH145-33)
Competing interests: The authors declare that they have no competing interests.
摘 要：胰腺癌作为一种常见的消化系统恶性肿瘤，生存率极低。近年来，胰腺癌在诊断方法、 放射治疗技术和全身化疗等方面取得了较大进展，但其治疗效果并没有明显提高。类器官作为一 种新型肿瘤研究平台，已在多个领域取得研究进展，通过构建胰腺癌类器官对胰腺癌的个体化治 疗进行指导具有重要研究价值。本文对类器官模型在胰腺癌放射治疗中的研究及临床应用前景进 行综述。
关键词：胰腺癌；类器官；肿瘤模型；放射治疗
0 引言
胰腺癌在所有常见恶性肿瘤中预后最差，被誉 为“癌中之王”，约80%的患者确诊时已处于局部晚期或已经发生远处转移，其5年生存率为11%~13%[1]。 文献数据显示，中国2016年胰腺癌新发病例数达到 10.04万例，病死例数达8.79万例，发病率与病死率 分别居所有恶性肿瘤的第十位和第六位[2]。胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC） 占所有胰腺癌病例的85%[3]，但PDAC的起病通常 比较隐匿，且对现有治疗方式（包括单独放疗或联 合化疗）的反应较差，治愈率极低。截至目前，国 内外胰腺癌的总体预后均不理想，如何提高胰腺癌 疗效任重而道远。 胰腺癌的理想治疗依赖于利用现代治疗技术为 患者量身定做治疗方案，但PDAC在一定程度上还 远未实现个性化治疗。虽然全基因组分析确定了胰 腺癌分子亚型[4-6]，促进了相关基础研究的发展，但不适当的临床前建模（如二维细胞培养、异种移植 物模型等）使以往研究成果很难从模型系统推断至人类自身。因此，迫切需要建立一种能够准确模拟人体肿瘤特征的实验模型，以开发出提高胰腺癌患者存活率的新型和更有效的疗法。 类器官是高度模仿人体病理生理系统的体外 3D迷你“器官”，可以由原代组织、胚胎干细胞、精原干细胞和多能干细胞等产生[7-9]。通过优化各种培 养条件建立的类器官模型，已经能够准确地模拟体 内肿瘤，在保持原始肿瘤的遗传和表型特征的同时 再现组织异质性和细胞微环境[10]，甚至重现部分人 体器官功能。现就胰腺癌类器官模型的构建及其在 放射治疗中的潜在研究及应用前景进行综述。
1 类器官技术
近一个世纪以来，动物细胞和器官的体外培养 和肿瘤模型的建立一直是科学界关注的话题。此前，二维细胞培养被广泛用于抗肿瘤药物筛选，但 由于缺乏肿瘤微环境[11]，体外过程中遗传和表观遗 传畸变的积累，可能会对干细胞的培养和细胞类型 的多样性产生负面影响[12-13]。此外，细胞间的交流 互动少、存在物种差异等因素，使二维细胞研究较 难获得人体中的准确反应。患者来源的异种移植物 （patient-derived xenograft, PDX）可以在很大程度上保留原始肿瘤的异质性[14]，为测试个性化抗癌药 物在药物筛选和新药开发中的有效性提供了一个潜 在平台。然而，这种模型由于成本高、培养周期 长，无法进行高通量筛选，难以满足深入的研究要 求。研究者们一直在努力寻找一种更为合适的体外 肿瘤模型，既能表现出更类似于人体的分子和形态特征，又能满足大规模的实验需要。 类器官技术的突破始于2009年，Clevers团队[15] 率先描述了一种人工提供特定生态位因子（如Rspondin、Noggin和表皮生长因子等）的培养系统， 在其培养条件下，成人肠道中的干细胞可以在体外增殖和自组织，并形成具有肠隐窝-绒毛结构的肠 类器官。一个月后，Ootani等[16]为长期稳健地培养 小鼠来源的小肠和大肠，将切碎的肠道碎片保存在 I型胶原凝胶的3D基质支架中，该方法可以达到持续肠道增殖和多谱系分化的效果。随后，脑、前列 腺、肾、乳腺等类器官模型也逐步建立成功[17-20]。 值得注意的是，Gao等[18]在前列腺癌类器官培养中发现，将类器官移植到小鼠体内产生的肿瘤，可以保留原始患者样本的组织学和免疫组织学微观特征，为后续抗肿瘤研究的结果增加了可信度。 2014年，Lancaster等[21]对类器官这一概念进行了系统描述，即由干细胞或器官祖细胞发育而来的器官特异性细胞类型的集合，通过细胞分化和空间限制 的谱系定向过程进行自组织，形成具有人体器官部分的空间结构和特定功能的3D结构。 目前，类器官已经从多种包括胰腺在内的人体正常组织和肿瘤组织中建立，并被证明是评估治疗反应的可靠临床前工具[22-24]。由于其能在维持来源组织的结构基础上，模拟体内组织的原始生物学特性，在肿瘤研究中具有不可替代的广泛应用价值。 利用类器官模型结合新兴的研究技术，能够突破传统模型的瓶颈，在器官水平上为疾病模型的建立、 药物研发、精准医疗以及再生医学等提供有价值的信息。在过去的十年中，许多研究已开始使用患者 来源类器官（patient-derived organoid, PDO）评估 抗癌药物疗效，为患者确定最佳治疗方法。
2 胰腺癌类器官培养
2013年，Clevers团队[25]将胰管片段与基质胶混 合，率先培养出胰腺组织类器官，且形成的类器官 能够扩增和传代至少9个月。两年后，Boj等[26]报道 了人类PDAC的第一个肿瘤类器官，其培养成功率高达75%，可无限传代并冷冻保存以备将来使用。 由于大多数PDAC患者无法手术，其团队用于培养 的原始组织除从手术切除的肿瘤中获得外，大多从 细针穿刺抽吸活检（fine-needle aspiration, FNA） 标本中取得。更为重要的是，其培养出的胰腺癌类 器官呈现出复杂的形态，具有不同程度发育不良的 高柱状细胞，类似于低级别胰腺上皮内肿瘤，接近 人类胰腺导管肿瘤细胞，为探索人类胰腺癌生物学 提供了更佳的模型系统。此后，胰腺癌类器官的培 养技术不断更新，并能以很高的成功率进行传代和保存。Huang等[22]利用手术切除的新鲜肿瘤组织培养的类器官，成功率高达85%。Romero-Calvo等[27] 在其实验中更是取得了近乎100%的胰腺癌类器官培养成功率，并能每周以1∶2的比例进行传代。值得注意的是，遵循目前的培养方法，胰腺癌类器官能够同时保留原始组织免疫和非免疫基质特征，非常接近真正的肿瘤。目前，胰腺癌类器官大多通过 手术切除、FNA获得的癌组织或人多能干细胞衍生 的上皮细胞构建。2022年，Wu等[28]利用循环肿瘤 细胞在体外扩增，顺利培养出胰腺癌类器官，开发了通过非侵入性手段达到培养目的的方法。
3 类器官在胰腺癌放疗中的应用前景 随着恶性肿瘤相关研究的更新以及医疗技术的迅猛发展，胰腺癌的临床治疗手段也日趋丰富，尤其是多学科诊疗（multi-disciplinary treatment, MDT） 模式的不断发展及推广，更是推动了胰腺癌的综合治疗，明显改善了治疗效果。图像引导放疗（image-guided radiation therapy, IGRT）、呼吸门控及实 时追踪等精准放疗技术的出现和剂量模式的发展 更新，使胰腺癌放疗在提高局控率的同时，改善了 患者的生活质量。放疗在胰腺癌治疗中的作用愈 发显著。近年来，类器官在肿瘤放疗中的研究取得 了令人瞩目的进展，其相关研究发现有望为临床实 践提供有效指导，提升胰腺癌患者的治疗效果和生 存率。 3.1 放疗疗效 胰腺癌放射治疗的疗效一方面取决于其对放射 线的敏感性，而放射敏感性受肿瘤的组织来源、分化程度和大体类型等因素影响。此外，患者特征 （年龄、环境因素、血红蛋白水平和合并症） 、放 疗物理参数（总剂量、每分数和体积辐照剂量、剂量均匀性） 、联合使用化疗和（或）手术等因素也 使肿瘤患者对放疗的反应呈现差异化和复杂化[29]。 随着类器官技术的不断更新，利用PDO模型研究 肿瘤对现有和新型治疗方案的反应也有了长足的发 展[30]。2019年，纪念斯隆-凯特琳癌症中心团队[31]从 原发性、转移性或复发性疾病患者中生成直肠癌类 器官，证实了直肠癌类器官模型可用于研究个体对 放疗的反应。随后，一项研究利用80名局部晚期直肠癌患者的组织构建了一个PDO生物库，并证实了 类器官与患者肿瘤具有相似的分子表达谱，可以预 测患者化放疗效果，强化了PDO作为肿瘤治疗中配套诊断工具的价值[32]。值得注意的是，该研究中大 多数病例的PDO治疗反应检测可在4周内完成，印证了PDO模型能够在具有临床意义的时间范围内预 测治疗效果。最近，Shukla等[33]进行了一项实验， 利用3D胰腺癌类器官评估体内肿瘤的精确放疗疗效。该实验将小鼠体内胰腺肿瘤和其衍生而来的类 器官均采用分次X线放疗并观察放疗效果，结果显示，肿瘤类器官与小鼠体内肿瘤生长情况一致，并 表现出与体内肿瘤相似的纤维化微环境和分子反应，表明胰腺癌类器官具有预测体内肿瘤对放疗反应的潜力。在其实验中，当胰腺癌类器官最大直径达到100 μm时即进行放化疗处理，在治疗后10天内 观察到类器官生长明显受到抑制。然而该实验虽然 研究了类器官与体内肿瘤在肿瘤微环境方面的差 异，表明胰腺肿瘤微环境中细胞成分的重要性，却 并未研究其对胰腺癌类器官放疗的影响，值得进一 步研究。目前，利用类器官研究胰腺癌放疗效果的 实验集中在动物身上，随着研究的深入，未来利用 PDO预测人体内肿瘤对放疗的敏感性，或将为临床 诊断和治疗提供更多依据。
3.2 联合治疗
胰腺癌由于其极易发生远处转移的特点，单一 放疗通常并不能取得理想的治疗效果，采取包括手 术、放化疗、靶向、免疫治疗等多种方式的联合治疗显得尤为重要。因此，通过建立适当的平台，重现患者对治疗的反应，为患者定制精准治疗方法可 能更有希望提高患者生存率[34]。Tiriac等[23]建立了 一个胰腺癌PDO库，囊括了原发性胰腺癌的突变 谱和转录亚型，在案例研究中发现PDO能对标准 化疗药物和研究药物表现出异质性反应，PDO治疗 特征与患者预后平行，并且PDO能够纵向评估化学 敏感性和同步转移。将PDO的基因组学、转录组学 和治疗分析相结合，可以识别胰腺癌的分子和功能 亚型，预测治疗反应，促进胰腺癌患者的精准医 疗。Nicolas等[35]为更有效地研究肿瘤微环境的影 响，将类器官移植到免疫功能正常的小鼠直肠内， 然后对类器官诱导的肿瘤进行精确的IGRT，建立 直肠癌的临床前小鼠模型。该模型的成功建立提高 了利用类器官进行个性化放疗的可能性。事实上， 在Shukla等[33]的研究中还将放疗联合化疗药物3-溴丙酮酸（3-bromopyruvic acid, 3BP）治疗与单独使用3-BP或单独放疗进行了疗效对比，结果显示协同 治疗的效果优于单独放疗或化疗。考虑到胰腺癌治 疗的复杂性和胰腺癌患者的个体差异，未来利用 胰腺癌类器官为患者定制个性化治疗方案，充分发 挥包括放化疗在内的各种治疗手段的优势具有研究 前景。
3.3 放疗不良反应
由于胰腺周围的重要器官多，且对射线敏感， 容易出现严重的放射损伤，使胰腺放射治疗时射线 剂量受到限制，通常限制了放疗的疗效[36]。胰腺癌作为腹部恶性肿瘤，患者在接受放疗后可能会出现 放射性肠炎，产生腹泻、腹痛、出血、肠狭窄、梗阻，甚至穿孔等症状，显著影响患者的生活质量。 有研究试图通过肠道类器官模型，找出促进肠道干 细胞再生以修复照射损伤的分子，结果提示添加 Wnt11条件培养基可以促进照射后新生类器官的增 殖，Wnt11是促进肠道干细胞再生以修复放射损伤 的潜在靶点[37]。除促进肠道干细胞再生外，添加有 效的放射保护剂也是另一研究方向。Park等[38]在其 研究中发现丙戊酸可以作为一种有效的放射保护 剂，通过NOTCH信号通路对LGR5+（leucine-richrepeat-containing G protein-coupled receptor-5-positive）干细胞产生强烈的保护作用，为改善胰腺癌 放射损伤的管理提供了理论基础。此外有研究发 现，纳米材料可以保护致死剂量的照射后类器官 模型中肠道干细胞的再生能力，预防急性辐射综合 征[39]。由此可见，类器官在胰腺癌放射损伤中的相 关实验结果未来可用于减少胰腺癌的放疗不良反 应，提高胰腺癌患者的生活质量。
4 小结
近年来，类器官已成为一种新兴的体外肿瘤模 型，可最大程度地还原胰腺癌细胞在体内的组织和 分子特性。胰腺癌类器官已被开发用于研究胰腺癌 生物学、进展和治疗反应，填补了体外和体内模型 之间的转化空白。作为开发新型精准医学策略的模 型系统，胰腺PDO有望成为PDAC患者实施治疗前对肿瘤的治疗敏感性进行快速评估的工具。然而， 目前对胰腺癌的研究尚处于初步阶段，由于相关研究样本量较小，很少有研究将胰腺PDO的治疗筛选 结果与患者的临床反应联系起来，尚不能对胰腺癌 临床治疗提供指导性的意见。考虑到该领域的技术 和方法学的快速进步，胰腺癌类器官模型会逐渐趋 于完善，未来在更大的患者团队中进行更为广泛的联合临床试验，加强基础研究向临床研究和治疗的 转化，探索新型治疗方法或弥补现有方法的不足， 可以更好地指导临床决策，提高患者生存率。
综上所述，类器官技术未来有望在探索胰腺癌放疗疗效、促进其联合治疗以及减轻放疗不良反应上发挥 重大作用，并成为制定个体化胰腺癌治疗方案的新型平台。
利益冲突声明： 所有作者均声明不存在利益冲突。
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[编辑：尤婷婷；校对：黄园玲] 作者贡献： 童姣姣：文献阅读和论文撰写 梁译尹、陈亮、许碧纯：文献查找及翻译 张火俊：论文修